L'Essentiel
Les réactifs utilisés dans l’étude
L’ATX (pureté à 95 %) a été obtenu auprès de Yuanye Co., Ltd. à Shanghai, en Chine. Les réactifs nécessaires pour les expériences, y compris le MDA (malondialdéhyde), le GSH (glutathion), le SOD (superoxyde dismutase) et l’ATP (adénosine triphosphate), ont été fournis par l’Institut de bioingénierie de Nanjing Jiancheng. De plus, les fils en nylon à tête ronde utilisés dans l’équipement expérimental ont été acquis auprès de Beijing Xinnuo Technology Co., Ltd.
Conception de l’expérimentation animale
Cette étude a sélectionné 75 rats mâles Sprague-Dawley adultes, pesant entre 250 g et 280 g, fournis par Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. L’expérimentation a scrupuleusement respecté les directives éthiques pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire établies par les National Institutes of Health, ainsi que les normes définies par le National Research Council des National Academies. L’environnement d’hébergement des animaux expérimentaux a été rigoureusement contrôlé, maintenant une température de 22 ± 2 °C, avec un cycle jour/nuit de 12 heures et un accès suffisant à la nourriture et à l’eau. L’humidité relative a été maintenue entre 50 % et 70 %. Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique pour l’expérimentation animale de l’Université de Médecine Chinoise de Changchun, avec un numéro d’approbation éthique de 2024427, et l’ensemble de l’expérience a été supervisé par ce comité. L’étude est rapportée conformément aux lignes directrices ARRIVE.
Les 75 rats ont été répartis aléatoirement en cinq groupes expérimentaux : le groupe témoin, le groupe modèle (groupe MCAO), le groupe ATX à forte dose (65 mg/kg, groupe H), le groupe ATX à dose moyenne (45 mg/kg, groupe M) et le groupe ATX à faible dose (25 mg/kg, groupe L). Les dosages d’administration sont basés sur nos études antérieures. Tous les groupes traités ont reçu de l’ATX (dissous dans du sérum physiologique) par gavage gastrique pendant 7 jours, tandis que les groupes témoin et MCAO ont reçu le même volume de sérum physiologique stérile. Les groupes de traitement ont commencé leur intervention ATX après l’établissement réussi du modèle et ont continué pendant 7 jours. Avant l’expérience, le poids corporel des rats a été enregistré, suivi d’une anesthésie par injection intrapéritonéale de solution de pentobarbital sodique à 2 % (2 mL/kg). Après l’anesthésie, les animaux expérimentaux ont été placés en position ventrale et maintenus à une température centrale d’environ 37 °C avec un coussin chauffant. Le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) a été établi selon la méthode de Longa : les artères carotidiennes commune, externe et interne ont été exposées par une incision médiane au cou. L’artère carotidienne commune a ensuite été soigneusement connectée à l’artère carotidienne externe. Une suture en nylon à bout rond a été doucement insérée dans l’artère carotidienne interne gauche jusqu’à ce qu’une légère résistance soit ressentie, essentiel pour induire les caractéristiques ischémiques du modèle MCAO. Les animaux expérimentaux ont été euthanasiés (injection intrapéritonéale de solution de pentobarbital sodique 100 mg/kg) au septième jour post-chirurgical pour une analyse ultérieure. Le groupe de contrôle a subi toutes les procédures chirurgicales identiques à celles du groupe modèle, sauf pour l’insertion de la suture en nylon, garantissant ainsi la comparabilité des effets d’intervention entre les groupes traités et non traités.
Évaluation des déficits neurologiques et du contenu en eau cérébrale
Les évaluations neurocomportementales ont été menées par des chercheurs ignorant les groupes. Sept jours après la construction du modèle MCAO, l’état fonctionnel neurologique des rats de chaque groupe expérimental a été évalué à l’aide du système de notation de Longa. Le poids corporel des rats a été enregistré, suivi d’une anesthésie par injection intrapéritonéale de solution de pentobarbital sodique (100 mg/kg). Parallèlement, le degré d’œdème dans le tissu cérébral ischémique a été quantifié par la méthode du rapport poids humide/poids sec. Cette méthode repose sur la mesure distincte du poids humide du tissu cérébral et de son poids après déshydratation. Le calcul de l’indice d’œdème suit l’expression mathématique : [(poids humide – poids après déshydratation) / poids humide] × 100 %. Cette formule offre un moyen technique pour documenter avec précision le degré d’œdème en pourcentage, reflétant objectivement la gravité des modifications pathologiques.
Analyse des métabolites intestinaux
Après avoir mesuré avec précision 50 mg d’échantillon de selles de rat (n = 6), celui-ci a été transféré dans un tube EP de 2 mL, puis 600 µL d’une solution de méthanol contenant 4 ppm de 2-chloro-L-phénylalanine, préalablement stockée à -20 °C, ont été ajoutés. L’échantillon a ensuite été vortexé pendant 30 secondes pour assurer un mélange complet. Dans le traitement suivant, des billes d’acier ont été ajoutées au mélange, qui a été placé dans un broyeur tissulaire fonctionnant à une fréquence de 50 Hz pendant 120 secondes pour homogénéiser complètement l’échantillon. Le mélange homogénéisé a été soumis à un traitement par ultrasons de 10 minutes à température ambiante, une étape cruciale facilitant l’extraction approfondie des métabolites intestinaux. Ensuite, le mélange a été centrifugé à 4 °C et 13 780 xg pendant 10 minutes pour séparer le surnageant du précipité. Le surnageant a été filtré à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer les particules résiduelles. Une portion du filtrat a été transférée dans un flacon de détection, où 20 µL ont été utilisés pour préparer des échantillons de contrôle qualité, et le reste a été utilisé pour analyse par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS). Le processus d’analyse des métabolites a impliqué l’analyse spectrale des fichiers de données brutes et la récupération de bases de données pour identifier qualitativement et quantitativement les métabolites présents dans les échantillons. La phase d’évaluation de contrôle qualité a été employée pour vérifier la précision et la fiabilité des résultats analytiques. Une analyse approfondie des métabolites identifiés, basée sur des méthodes statistiques multivariées, a efficacement révélé les caractéristiques différentielles entre différents groupes d’échantillons.
L’analyse des métabolites et des tests biologiques décrits permettent de mieux comprendre les processus biochimiques en jeu dans les états pathologiques et d’évaluer les mécanismes d’action potentiels sur les modèles animaux utilisés dans cette recherche. Ces approches expérimentales visent à fournir des informations précieuses pour le développement thérapeutique ultérieur dans le traitement des maladies neurologiques.
